library(Seurat)
library(ROGUE)
library(presto)
library(dplyr)
library(here)
library(ggplot2)
knitr::opts_knit$set(
root.dir = "/home/oandrefonseca/Disciplinas/PPGBM0117.2025.1",
verbose = FALSE
)
# Aumentar o limite de uso de memoria
options(future.globals.maxSize = 5 * 1024^3) # 5 GB, por exemplo04 - Redução de dimensionalidade e clusterização
Motivação
Em experimentos de transcriptômica de célula única (scRNA-seq), a alta dimensionalidade dos dados — frequentemente composta por milhares de genes — dificulta a análise direta e a interpretação biológica. Para identificar populações celulares de forma robusta, é necessário reduzir essa dimensionalidade preservando as principais variações biológicas. Posteriormente, técnicas de clusterização são empregadas para agrupar células com perfis transcriptômicos semelhantes, revelando estruturas ocultas nos dados, como tipos celulares ou estados funcionais distintos.
Este tutorial descreve as etapas fundamentais de união de amostras, redução de dimensionalidade, clusterização e subclusterização de células, utilizando o pacote Seurat.
Contextualização
Neste tutorial, trabalharemos com objetos do Seurat e utilizaremos as seguintes funções principais:
merge()— para unir objetos de diferentes amostras.SCTransform()ouNormalizeData()— para normalização e modelagem da variação técnica.RunPCA()— para a redução inicial de dimensionalidade via Análise de Componentes Principais (PCA).FindNeighbors()eFindClusters()— para identificar agrupamentos celulares.RunUMAP()ouRunTSNE()— para projeção em duas dimensões, facilitando a visualização.Subset()— para subclusterizar grupos de interesse.
Unindo amostras
Antes de qualquer redução de dimensionalidade, é necessário unir diferentes amostras em um único objeto Seurat. Para isso, usamos a função merge(). Abaixo um exemplo de codigo de realizar a juncao.
# Listar os arquivos RDS
files <- list.files(
path = "path/to/your/objects", pattern = "\\.rds$", full.names = TRUE)
# Carregar todos os objetos em uma lista
seurat_list <- lapply(files, readRDS)
# Criar identificadores a partir dos nomes dos arquivos
sample_ids <- gsub("\\.rds$", "", basename(files))
# Fazer o merge
seurat_merged <- merge(
x = seurat_list[[1]],
y = seurat_list[-1],
add.cell.ids = sample_ids,
project = "ProjectName"
)Salvando o objeto do Seurat
if(!file.exists("./data/seurat_object.RDS")) {
saveRDS(file = "./data/seurat_object.RDS", object = seurat_merged)
}# Objeto contendo todas as amostras
seurat_object <- readRDS(file = here::here("./data/seurat_object.RDS"))Normalização
seurat_object <- NormalizeData(
seurat_object, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)Normalizing layer: countsseurat_object <- FindVariableFeatures(
seurat_object, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)Finding variable features for layer countsseurat_object <- ScaleData(
seurat_object, features = VariableFeatures(seurat_object))Centering and scaling data matrixWarning: Different features in new layer data than already exists for
scale.dataRedução de dimensionalidade (PCA)
seurat_object <- RunPCA(seurat_object, npcs = 50, verbose = FALSE)ElbowPlot(seurat_object, reduction = "pca")
Note
O ElbowPlot(seurat_object) é utilizado para identificar o número apropriado de componentes principais (PCs) a serem considerados nas análises downstream, como clusterização e redução de dimensionalidade. O gráfico exibe a variação explicada por cada PC; o ponto onde há uma inflexão (“cotovelo”) indica que PCs adicionais contribuem pouco para a variabilidade dos dados. Selecionar o número correto de PCs é essencial para capturar a estrutura biológica relevante, minimizando ruído técnico.
Visualizando dimensões
# Examine and visualize PCA results a few different ways
VizDimLoadings(seurat_object, dims = 1:2, reduction = "pca")
Extraindo informacões do PCA
# Get cell embeddings and feature loadings stored on pbmc[['pca']]@cell.embeddings
Embeddings(seurat_object, reduction = "pca")
# stored in pbmc[['pca]]@feature.loadings
Loadings(seurat_object, reduction = "pca")Construção da matriz de vizinhança
seurat_object <- FindNeighbors(seurat_object, dims = 1:20)Computing nearest neighbor graphComputing SNN
Note
A função FindNeighbors constrói uma matriz de vizinhança baseada nos embeddings de redução de dimensionalidade (tipicamente PCA). Cada célula é conectada às suas células mais próximas no espaço de baixa dimensão, formando um grafo de similaridade.
Esse grafo é o alicerce para a clusterização subsequente (FindClusters()), permitindo identificar comunidades de células com perfis transcriptômicos semelhantes. O parâmetro dims especifica quais componentes principais serão usados para calcular as distâncias entre as células.
Clusterização
seurat_object <- FindClusters(
seurat_object, algorithm = 4, resolution = c(0.25, 0.5, 1.0))
Note
A função FindClusters realiza a clusterização das células com base na matriz de vizinhança previamente calculada.
Ela aplica algoritmos de otimização de comunidades (como o algoritmo Louvain ou Leiden) para agrupar células com perfis transcriptômicos semelhantes.
O parâmetro resolution controla a granularidade da clusterização, por exemplo: - Valores mais baixos (< 0.5) resultam em menos clusters (agrupamentos maiores). - Valores mais altos (> 0.5) resultam em mais clusters (agrupamentos menores e mais específicos).
A escolha do resolution deve ser guiada tanto por critérios biológicos quanto por inspeção visual dos agrupamentos gerados.
# Explore as resolutions
DT::datatable(seurat_object@meta.data)Warning in instance$preRenderHook(instance): It seems your data is too big for
client-side DataTables. You may consider server-side processing:
https://rstudio.github.io/DT/server.html